一. 探針選擇要求 ①適當(dāng)?shù)奶结橀L度；②能對探針進(jìn)行率的標(biāo)記；③能長期保持穩(wěn)定。核酸探針多種多樣，基本上可分為DNA、RNA和人工合成寡核苷酸三大類。 二. 不同探針的對比 類型 簡介 備注說明 DNA和RNA探針 特異的DNA或RNA片段→裝載到相應(yīng)的質(zhì)粒中→質(zhì)粒擴(kuò)增，酶解和純化等→即可大量的DNA和RNA片段 可購買純化好的探針，再獲得一裝載好特異性DNA或cDNA片段的質(zhì)粒。 寡核苷酸探針 在待查序列已知的情況下，簡單而又經(jīng)濟(jì)的用途是合成寡核苷酸探針，寡核苷酸探針的長度一般為10-100bp，探針越短，性越好，但結(jié)合不太穩(wěn)固。 ①長度20-30bp； ②合成探針的時(shí)候可以摻入半抗原如、生物素和FITC等。寡核苷酸探針也可用3′末端標(biāo)記法予以標(biāo)記。 三. 探針標(biāo)記 各種不同類型的探針需要經(jīng)過恰當(dāng)?shù)臉?biāo)記，才能在原位雜交中應(yīng)用。 類型 標(biāo)記方法 DNA探針 隨機(jī)引物標(biāo)記、切口平移法 寡核苷酸探針 3＇末端標(biāo)記 1、切口平移法(nick translation) （1）按下列配比混合：未標(biāo)記的dNTP 10μl、10×切口平移緩沖液5μl、待標(biāo)記的DNA 1μg、[α-32P]dCTP或dATP(70μCi) 7μl、E.coli DNA聚合酶4U、DNA酶Ⅰ1μl，加水至終體積 50μl； （2）置于 15℃ 水浴60min； （3）加入5μl EDTA終止反應(yīng)； （4）反應(yīng)液中加入醋酸銨，使終濃度為0.5mol/L，加入兩倍體積預(yù)冷沉淀回收DNA探針。 　 2、隨機(jī)引物合成法 隨機(jī)引物合成雙鏈探針是使寡核苷酸引物與DNA模板結(jié)合，在Klenow酶的作用下，合成DNA探針。合成產(chǎn)物的大小、產(chǎn)量、比依賴于反應(yīng)中模板、引物、dNTP和酶的量。通常，產(chǎn)物平均長度為400～600個(gè)，可以獲得大量的探針。 其步驟 （1）200ng雙鏈DNA(1μl)和7.5ng隨機(jī)引物(1μl)混合后置于Eppendorf管內(nèi)，水浴煮沸5min后，立即置于冰浴中1min。 （2）與此同時(shí)，盡快在一置于冰浴中的0.5ml Eppendorf管內(nèi)混合下列化合物：20mmol/L DTT 1μl、未標(biāo)記的dNTP溶液 1μl、10×隨機(jī)標(biāo)記緩沖液 1μl、[α-32P] dATP(比3000Ci/mmol；10μCi/μl) 3μl、ddH2O 1μl。 （3）將步驟(1) Eppendorf管中的溶液移到步驟（2）管中。 （4）加入5U(約1μl) Klenow片段，充分混合，在微型離心機(jī)中以12 000g 離心1～2s，使溶液沉于試管底部，在室溫下保溫3～16h。 （5）在反應(yīng)液中加入10μl緩沖液A后，將放射性標(biāo)記的探針保存在 -20℃ 下備用。同時(shí)計(jì)算放射比。